ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
ХОМЕНЧУК Володимир Олександрович
УДК 577.1: 597.554.3: 546.3
БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ПРОНИКНЕННЯ І РОЗПОДІЛУ ДЕЯКИХ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ В ОРГАНІЗМІ КОРОПА ЛУСКАТОГО
03.00.04 - біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Тернопільському державному педагогічному університеті ім. Володимира Гнатюка Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник доктор біологічних наук, професор
Грубінко Василь Васильович,
Тернопільський державний педагогічний
університет ім. Володимира Гнатюка,
завідувач кафедри загальної біології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Янович Вадим Георгійович,
Інститут біології тварин УААН,
завідувач лабораторії росту і розвитку
доктор біологічних наук, професор
Арсан Орест Михайлович,
Інститут гідробіології НАН України,
завідувач відділу екотоксикології
Провідна установа: Чернівецький національний університет ім. Ю. Федьковича Міністерства освіти і науки України, кафедра біохімії, м. Чернівці
Захист відбудеться “16” грудня 2003 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.
Автореферат розісланий “15” листопада 2003 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради Віщур О.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Водні організми розвивались і еволюціонували за наявності в навколишньому середовищі іонів різних металів, у тому числі і токсичних. Тому в них виробились механізми підтримання оптимального їх рівня в клітинах. Зростання вмісту токсичних металів у водному середовищі, внаслідок широкого використання їх у промисловості приводить до перевищення їх рівня в організмі гідробіонтів, веде до надмірного акумулювання їх водними організмами і порушення метаболізму (Мур Дж., Рамамурті С., 1987; Евтушенко Н.Ю. и др., 1996; Петухов С.А., 1983). Токсичність металів для водних організмів змінюється в залежності від температури, рН середовища, іонної сили, вмісту кисню, наявності хелатуючих агентів, особливостей живлення організму та інших факторів (Патин С.А. и др., 1981; Hogstrand С. et al. 1996).
У даний час вплив підвищених концентрацій важких металів на метаболічні процеси в організмі гідробіонтів, закономірності їх акумулювання в тих чи інших органах та тканинах вивчено досить добре. Однак, механізми внутрішньоклітинного розподілу важких металів у залежності від концентрації токсиканта та особливості енергетичного забезпечення цих процесів вивчені мало. Відомо, що при наявності у водному середовищі іонів різних важких металів значно змінюється їх проникнення, розподіл та накопичення в клітинах, у зв’язку з чим науково-практичний інтерес становить дослідження їх взаємодії порівняно з дією кожного з них окремо. Останнім часом активно досліджуються транспортні системи проникнення іонів важких металів у клітину. В основному об’єктом досліджень є прокаріоти та дріжджі. Відомо, що кінетика проникнення важких металів в організм риб має ряд спільних рис, однак характеризується більш складними механізмами регуляції, які потребують дальшого вивчення.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є складовою частиною досліджень лабораторії екологічної біохімії Тернопільського державного педагогічного університету ім. В. Гнатюка і виконувалася в рамках науково-дослідних тем держбюджетної тематики Міністерства освіти і науки України:“Молекулярні механізми впливу важких металів на організм прісноводних риб” (1996-1997 рр., номер держреєстрації 0196U012314), в якій автор досліджував особливості тканинного накопичення досліджуваних металів; “Дослідження метаболічної ролі амінокислот в адаптаційно-компенсаторних поцесах в організмі тварин при екологічних стресах” (1999-2000 рр., номер держреєстрації 0199U002522); “Токсико-специфічні адаптації гідробіонтів та водних екосистем до іонів важких металів та їх регуляція” (2001-2003 рр., номер держреєстрації 0101U000303), де автором досліджувались особливості субклітинного розподілу важких металів та активності сукцинатдегідрогенази і цитохромоксидази мітохондрій зябер та печінки при дії підвищених концентрацій металів у воді.
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження є вивчення субклітинного розподілу іонів важких металів (Mn2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+) у тканинах коропа, кінетичних параметрів поглинання іонів металів у клітини зябер та кишечника риб і енергетичного забезпечення цих процесів залежно від вмісту їх у воді.
У завдання дослідження входило:
-
вивчення концентраційної залежності процесу накопичення іонів металів у печінці, зябрах та м’язах коропа;
-
дослідження розподілу марганцю, міді, цинку та свинцю в субклітинних фракціях печінки, зябер і м’язів;
-
з’ясування особливостей внутрішньоклітинного розподілу досліджуваних металів при їх спільному знаходженні у водному середовищі;
-
вивчення енергетичної залежності накопичення важких металів (активність сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази зябер та печінки, загальна АТФ-азна активність зябер);
-
дослідження кінетики накопичення міді ентероцитами та зябровими клітинами коропа.
Об’єкт дослідженння - проникнення і розподіл важких металів в організмі риб та енергетичне забезпечення даних процесів.
Предмет дослідження - показники акумулювання важких металів тканинами та їх субклітинними компонентами, активності сукцинатдегідрогенази і цитохромоксидази мітохондрій зябер та печінки, загальної АТФ-азної активності зябер; кінетика проникнення важких металів в організм коропа.
Методи дослідження - загальноприйняті методи відбору досліджуваних тканин (зябра, печінка скелетні м’язи), ультрацентрифугування для виділення субклітинних фракцій (ядра, мітохондрії), спектрофотометрія при визначенні активності ферментів (сукцинатдегідрогеназа, цитохромоксидаза, АТФ-ази), атомно-адсорбційна спектрофотометрія для визначення вмісту марганцю, цинку, міді та свинцю, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. У результаті дослідження вперше отримано дані про формування адаптивних систем захисту організму риб від токсичного впливу важких металів шляхом їх внутрішньоклітинного перерозподілу. Встановлено, що токсична дія металу залежить від його природи та концентрації. При цьому максимальна доза не обов’язково є найбільш токсичною. Виявлено складний характер взаємодії між металами при комплексному їх впливі, що обумовлено спільними механізмами їх транспорту і підтримання іонного гомеостазу. Встановлено (in vitro), що проникнення іонів важких металів у зябра та кишечник коропа є регульованим до певної концентрації процесом. У залежності від концентрації іонів металу в середовищі та температури реалізуються різні механізми транспорту важких металів.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть бути використані як біонормативні показники при розробці рекомендацій з оцінки якості рибної продукції та рівня токсичності водного середовища. Одержані дані використані на лекційних та практичних заняттях з екології у вищих навчальних закладах.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно опрацьовано літературу, проведено більшість біохімічних і фізико-хімічних досліджень дисертаційної роботи, статистичну обробку одержаних даних, аналіз та інтерпретація одержаних результатів проведено за участю наукового керівника. Визначення вмісту важких металів у тканинах і субклітинних фракціях коропа виконані з допомогою співробітників Тернопільської обласної державної санітарно-епідеміологічної станції, за що автор висловлює їм щиру подяку.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, які проводились в ході виконання дисертаційної роботи, доповідались на VІІ та VIII Українських біохімічних з’їздах (Київ, 1997; Чернівці, 2002); ІІ та ІІІ з’їзді гідроекологічного товариства України (Київ, 1997; Тернопіль, 2001); І та ІІ Міжнародних симпозіумах “Metal and cells” (Кентербері, Англія, 1997, 2001); І Всеукраїнській науковій конференції “Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль, 1998); Конференції присвяченій 100-річчю з нагоди дня народження Гжицького С.З. (Львів, 2000); Всеросійській конференції “Современные проблемы водной токсикологии” (Ярославль, 2002 р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 праць, з яких 6 – у фахових виданнях, 1 робота у науковому журналі та 6 у матеріалах і тезах конференцій та симпозіумів.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел (всього 298 найменувань), з них 71 кирилицею та 227 латиницею). Робота проілюстрована 14 таблицями та 27 рисунками. Загальний обсяг ілюстрацій та таблиць – 22 сторінок, списку використаних джерел – 33 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на коропах Суprinus carpio L. дворічного віку масою 250-300 г. Перед дослідом риб утримували 3 доби в басейнах об’ємом 2 м3. В експериментах риб утримували в лабораторних акваріумах об’ємом 200 л з розрахунку 40 л на одну особину. Риб під час аклімації не годували. Досліджувався вплив на риб іонів Mn2+ при концентраціях відповідно 0,12, 2,4 та 6,0 мг/л, Сu2+ – при 0,01, 0,2 та 0,5 мг/л, Zn2+ – при 0,1, 2,0 та 6,0 мг/л, Pb2+ – при 0,01, 0,2 та 0,5 мг/л, що відповідають 0,1, 2 та 5 санітарно-гігієнічним гранично-допустимим концентраціям (ГДК) (Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А., 1985). Також вивчали спільний вплив іонів марганцю (0,12 мг/л), міді (0,01 мг/л), цинку (0,1 мг/л) і свинцю (0,01 мг/л). Необхідні концентрації іонів металів у всіх серіях дослідів створювались шляхом внесення в середовище відповідних концентрацій ZnSO4, MnCl2, CuSO4 та Pb(NO3) 2 “х.ч.”. За контроль правили досліджувані показники в риб, що утримувались у середовищі без додавання солей металів. Період аклімації становив 14 діб, що вважається достатнім для формування адаптивних захисних механізмів при дії вищевказаних токсикантів (Хлебович В.В., 1981).
Для дослідження відбирали тканини передньої долі печінки, зябрових дуг і білих м’язів коропа. Досліджували наступні показники: вміст металів в усіх тканинах та їх субклітинних фракціях (мітохондріях, ядрах, цитоплазмі), активність цитохромоксидази і сукцинатдегідрогенази в мітохондріальних фракціях зябер і печінки, загальну АТР-азну активність у гомогенаті зябер.
Вміст цинку, міді, марганцю визначали методом атомно-адсорбційної спектрофотометрії на спектрофотометрі С-115М, свинцю – на S-600. Крім цього визначали активність сукцинатдегідрогенази (Методы…, 1977) та цитохромоксидази (Straus W., 1954), загальну АТФ-азну активність (Flik G. et al., 2000).
В умовах in vitro досліджували концентраційну, часову та температурну залежність проникнення іонів міді в зябра коропа і передній відділ кишечника коропа. Іони міді додавали до середовища у вигляді сульфату. Як інкубаційне середовище використовували розчин Рінгера для холоднокровних.
Рівень накопичення металу у тканинах визначали як різницю між вмістом металів у контрольній (без додавання іонів металу) і дослідній групах риб та виражали в нг/мг білка. Величини енергії активації (Eакт) визначали з допомогою графічного способу Ареніуса (Диксон М., Уэбб Э., 1982). Вміст білка в тканинах визначали за Лоурі та співавт. (Loury О. et al., 1951). Одержані цифрові дані опрацьовували статистично (Лакин Г.Ф., 1990).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Особливості накопичення досліджуваних важких металів у тканинах риб. Оцінка ступеня акумуляції металів у тканинах риб була проведена при трьох різних концентраціях їх у воді. Проведені дослідження показали, що концентрація іонів металу у водному середовищі є основним фактором, який впливає на проникнення і накопичення важких металів у тканинах коропа (Патин С.А. и др., 1981; Воробьов В.И., 1979; Евтушенко Н.Ю. и др., 1996). Було встановлено, що вміст цинку у тканинах риб був на два порядки вищий від вмісту інших досліджуваних металів, що зумовлено видовими особливостями накопичення аномально високих концентрацій цинку у тканинах коропа (Lian T.S., Jeng S.S., 1998). Проте, накопичення цинку в тканинах коропа при дії його підвищених концентрацій відсутнє, що вказує на високий рівень регуляці цинкового гомеостазу в його організмі (табл. 1). Одним з можливих пояснень низького ступеня акумулювання цинку в тканинах коропа при низьких його концентраціях у воді є те, що цинк як мікроелемент в основному потрапляє в організм гідробіонтів разом з іжею через кишковий тракт (Bauden J., 1985).
Таблиця 1
Вміст цинку, марганцю, міді і свинцю в тканинах коропа (Мm, мг/кг вологої тканини, n=5)
Досліджувані
Тканини | Контроль група | Дослідні групи
2 ГДК | 5 ГДК
Zn2+
Мязи | 13,10,24 | 21,31,52** | 27,631,75***
Печінка | 205,016,09 | 206,07,46 | 201,211,23
Зябра | 267,27,00 | 291,011,51 | 253,713,56
Mn2+
М’язи | 0.440,05 | 0,320,02** | 0,220,03**
Печінка | 0,920,01 | 1,530,20* | 1,710,11**
Зябра | 1,260,11 | 1,910,10* | 2,530,26*
Cu2+
Мязи | 0,590,06 | 1,350,21* | 0,660,04*
Печінка | 6,581,82 | 18,541,34** | 13,470,95**
Зябра | 0,970,07 | 11,630,79*** | 5,010,45***
Pb2+
Мязи | 0,760,16 | 0,700,08 | 0,860,11
Печінка | 0,550,06 | 0,610,11 | 0,530,09
Зябра | 2,700,13 | 3,210,08* | 3,700,17**
Примітка. * - cтупінь вірогідності різниць у досліджуваних показниках у риб дослідних груп, порівняно до риб контрольної групи (* - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001)
З одержаних результатів випливає, що в межуючих з зовнішнім середовищем тканинах коропа накопичення металів проходить більшою мірою, ніж у внутрішніх. Дана тенденція характерна для марганцю і свинцю. Висока спорідненість до важких металів, особливо до міді, відзначена для печінки. У загальному, при зростанні концентрації іонів металу в воді ступінь акумулювання його тканинами коропа, за винятком міді, зростає. Максимальне накопичення міді у тканинах коропа спостерігається при 2 ГДК іонів металу у воді.
Найбільшою мірою до накопичення в тканинах коропа при підвищеній концентрації іонів металу у воді характеризуються мідь та марганець.
Серед досліджуваних тканин найбільшою здатністю до акумулювання міді володіє печінка, до накопичення цинку, марганцю і свинцю – зябра.
М’язи характеризуються найменшою здатністю до акумулювання важких металів, що можна пояснити значно меншою їх метаболічною активністю.
Субклітинний розподіл важких металів у тканинах коропа. Особливістю металів як забруднювачів є те, що на відміну від органічних забруднючих речовин, що піддаються метаболічному розпаду, метали здатні лише до міжорганного і міжклітинного перерозподілу (Патин С.А. и др., 1981).
Особливо виражений субклітинний перерозподіл марганцю в тканинах коропа залежно від його концентрації (рис. 1). Найбільший вміст марганцю виявлено у мітохондріях печінки і зябер. Так, вже при 0,1 ГДК іонів марганцю у воді має місце його накопичення в мітохондріях цих тканин металу. При зростанні концентрації іонів металу в середовищі в період аклімації проходить збільшення кількості акумульованого металу в усіх досліджуваних субклітинних фракціях зябер та печінки, особливо в мітохондріях.
Вміст металу, нг/мг білку | а | б
Рис. 1. Вміст марганцю в окремих фракціях клітин печінки (а) та зябер (б) при підвищених концентраціях його у водному середовищі.
Примітка. К-контроль, Д-дослід.
Порівняно високий вміст марганцю виявлено також у ядерній фракції зябер коропа. Особливо чітко ця тенденція прослідковується в ядрах всіх досліджуваних тканин при 2 ГДК іонів марганцю: його вміст збільшується в 2,7 рази в печінці, в 4,4 – у зябрах; у 2 рази в м’язах.
При інтоксикації міддю спостерігається зростання кількості металу в усіх субклітинних фракціях печінки при дії сублетальних його концентрацій, за винятком цитоплазми при 2 ГДК (рис. 2). Проте, максимальне накопичення міді в мітохондріях спостерігається саме при дії 2 ГДК металу. При найнижчій концентрації відзначено тенденцію до зростання кількості металу в усіх досліджуваних субклітинних фракціях печінки.
У клітинах зябер розподіл іонів міді носив інший характер ніж у печінці. Зокрема виявлено високий ступінь акумулювання металу при дії іонів міді в усіх досліджуваних концентраціях у мітохондріальній і цитоплазматичній фракціях. Відомо, що мідь у зв’язаній формі транспортується з цитоплазми до внутрішньої мембрани мітохондрій, де використовується в основному при синтезі цитохром с оксидази (Rensing С. et al., 2000). При дії допорогової і сублетальних концентрацій іонів міді її вміст у мітохондріях знаходиться у близьких межах. При сублетальній концентрації кількість міді в ядерній фракції зростала пропорційно зростанню її вмісту у водному середовищі, а при за дії 0,1 ГДК металу виявлено зменшення його вмісту. Очевидно, високий рівень акумулювання міді в ядрах при інтоксикаціях міддю викликає мутагенну дію (Иванов В.Н. и др., 1983) та порушує білок-синтезну функцію (Евтушенко Н.Ю. и др., 1990).
Вміст металу, нг/мг білку | а | б
Рис. 2. Вміст міді в окремих фракціях клітин печінки (а) та зябер (б) при підвищених концентраціях її у водному середовищі.
Примітка. К-контроль, Д-дослід.
Найменші зміни акумулювання іонів міді при підвищенні її концентрації у воді виявлено в субклітинних фракціях м’язів, які найменше акумулюють мідь (Евтушенко Н.Ю. и др.,1996). Проте, кількість міді у мітохондріях м’язів при її високому рівні у воді зростає, що можна пояснити тим, що мідь, як елемент, який може змінювати валентність, у мітохондріях може брати участь в метаболічних процесах аналогічно до заліза (Патин С.А. и др., 1981.)
Рівень цинку в субклітинних фракціях усіх досліджуваних тканин коропа в середньому на один-два порядки вищий, ніж вміст інших досліджуваних металів. Однак при усіх дозах металу, крім 5 ГДК у цитоплазмі, не спостерігалося його акумулювання у субклітинних фракціях печінки (рис. 3)
Зябра відіграють провідну роль у регуляції надходження цинку до організму, риб (Galvez F., 1998, Hogstrand C., 1998). Вірогідні зміни рівня цинку в зябрах спостерігаються тільки при максимальній його концентрації у воді, що вказує на наявність у риб ефективної системи регуляції вмісту цього металу.
Вміст металу, нг/мг білку | а | б
Рис. 3. Вміст цинку в окремих фракціях клітин печінки (а) та зябер (б) при підвищених концентраціях його у водному середовищі.
Примітка. К-контроль, Д-дослід.
При інтоксикації свинцем у дозі 5 ГДК виявлено зменшення його в 4 рази, у порівнянні до його вмісту в ядрах печінки риб контрольної групи.
Незначне накопичення свинцю в субклітинних фракціях гепатопанкреасу можна пояснити також тим, що печінка риб не депонує цей токсикант. Відомо, що цей метал не приймає участі в метаболічних процесах і є типовим токсикантом (Мур Дж., Рамамурти С., 1987).
При дослідженні вмісту свинцю в субклітинних фракціях м’язів у досліджуваних риб виявлено зростання його рівня в цитоплазматичній фракції при 2 та 5 ГДК, тоді як в ядрах та мітохондріях змін вмісту металу не виявлено, за винятком його підвищення в ядерній фракції при 2 ГДК,
коли спостерігали зменшення рівня металу (рис. 4).
Очевидно, в даному випадку домінує зв’язування токсиканту з білками цитоплазми, внаслідок чого зменшується його надходження до інших компартментів клітини.
Отже, для різних металів існують індивідуальні закономірності накопичення у різних клітинних органелах. Проте, загальними тенденціями, які визначають внутрішньоклітинну локалізацію металів у риб є: тканинна специфіка їх будови, хімічного складу і мембранної активності, здатність металів утворювати комплекси з білками і низькомолекулярними метаболітами, концентрація іонів і їх вплив на загальний іонний гомеостаз та швидкість їх транспорту у клітинні органели.
Вміст металу, нг/мг білку | а | б
Рис. 4. Вміст свинцю в окремих фракціях клітин печінки (а) та зябер (б) при підвищених концентраціях його у водному середовищі.
Примітка. К-контроль, Д-дослід.
Накопичення важких металів у субклітинних компонентах тканин коропа при спільній їх дії. Відомо, що в природі водні організми зазнають впливу багатьох факторів. Часто зустрічаються випадки перевищення ГДК відразу для декількох металів, або ж на фоні зростання концентрації іонів одного металу спостерігається зниження вмісту інших. Одночасна присутність декількох металів в організмі впливає на їх перерозподіл та біологічну дію.
Відомо, що зябра володіють високою спорідненістю, до іонів марганцю, проте, нами відмічено послаблення сорбції іонів марганцю клітинами зябрового епітелію при спільній дії досліджуваних металів. Причиною цього може бути конкуренція за спільні місця зв’язування на мембрані з іншими металами, зокрема з цинком (Glynn А., 2001).
Найбільші зміни у розподілі марганцю при спільній дії іонів металів спостерігаються в скелетних м’язах. Відмічено зменшення вмісту марганцю в усіх субклітинних органелах. Це можна пояснити перерозподілом металів на тканинному і клітинному рівнях для забезпечення нормального функціонування в організмі риб при металічній інтоксикації.
У загальному, одержані результати дозволяють зробити висновок, що комплексна дія досліджуваних металів призводить до послаблення поглинання іонів марганцю в зябрах або спричиняє посилення екскреції металу з організму.
Встановлено, що при дії іонів міді вже при 0,1 ГДК відбувається збільшення вмісту металу в печінці коропа, тоді як у всіх досліджуваних органелах гепатоцитів при комплексному впливі іонів металів відмічена тенденція до зменшення вмісту міді. З цих даних випливає, що при дії декількох металів перешкоджається надходження металу в організм коропа, або порушується здатність печінки депонувати мідь.
У зябрах коропа накопичення міді в субклітинних фракціях при наявності у воді інших досліджуваних металів відсутнє, що може бути обумовлено конкуренцією між ними за переносники. Відомо, що між вмістом свинцю, міді і цинку спостерігається антагонізм при їх накопиченні за механізмом конкурентного інгібування (Ерзинкян К.Л. и др., 1990, Суханов Б.П. и др., 1990).