Як і в політичному та соціально-економічному відношенні, центр церковної та культурної діяльності на Україні на початку XVII ст. також переміщується на схід. Безпосереднє сусідство Волині та Галичини з Польщею де свого апогею сягнула католицька Контрреформація, зумовлювало те, що осередки українського православ'я на цих землях зазнавали безперервного згубного впливу. Так, коли в 1608 р. помер князь Костянтин Острозький, цей "стовп православ'я", його онука, новонавернена й фанатична католичка Анна Ходакевич, передала Острозьку академію єзуїтам. Львівське братство також почало занепадати. Оскільки українські міщани більше не в змозі були підтримати його, терплячі все більші утиски з боку католицької церкви та польського уряду. В той же час східні воєводства, що швидко розвивалися, перебували далеко від тиску польського католицизму. І знову Київ, що все густіше заселявся й багатшав, відносився як центр українського православ'я.
Рушійною силою православного відродження на новоосвоюваних землях України була стародавня Києво-Печерська лавра. У 1610-х роках її архімандрит Єлісей Плетенецький, виходець із галицької знаті, згрупував навколо себе освічених священнослужителів, переважно галичан, зокрема Івана Борецького, Тарасія Земку, Зазарію Копистенськог, Памву Берингу та Лаврентія Зизанія. Придбавши друкарський верстат, Платенецький узявся здійснювати грандіозний видавничий проект, за яким протягом 15 років було опубліковано близько 30 книг головним чином релігійного змісту. Це перевищувало загальну кількість усіх книжок, надрукованих на Україні до того часу. В 1615 р., отримавши гроші, заповідані багатою православною шляхтичкою Єлизаветою Гуревич, знать, міщани та духовенство Києва, натхнені цим прикладом, заснували при Богоявленській церкві братство.
Це братство підтримувало тісні взаємини із запорожцями. Початок цим контактам, ймовірно, поклав Йосип Курцевич, настоятель монастиря у Терехтемирові - місті, де розміщувалися козацький шпиталь, арсенал і скарбниця. До 1610 р. вони настільки зміцніли, що козаки відкрито оголосили: "Ми підтримуємо православ'я і духовенство, що не зрадило нашої старої віри". У 1620 р. запорожці на чолі з Сагайдачним вступили до Київського братства і, що дуже важливо, всіляко сприяли висвяченню нових православних ієрархів. Ця подія мала величезне значення. Адже з укладенням Берестейської унії в 1596 р. та приєднанням до неї переважної більшості єпископів православна церква втратила своїх ієрархів. Коли патріарх єрусалимський Феофан висвятив кількох єпископів і рукопоклав Іова Борецького на митрополита київського, православні українці знову мали своїх церковних владик. Як і належало чекати, у католиків і греко-католиків цей "незаконний", як вони його оголосили, як викликав лють. Однак польському урядові потрібна була підтримка козаків у веденні війни, тому він не втручався у справи, і нова православна ієрархія дістала визнання.
Події 1620 р. значно загострили ворожнечу між православними та греко-католиками. На додаток до розбіжностей із питань догми та церковних обрядів між ними розгорівся затяжний конфлікт за церковні володіння. Суперечка довкола права розпоряджалися церквами, монастирями із закріпленими за ними землями досягало такої гостроти, що у сутичках, які нерідко були заздалегідь спланованими битвами, з обох сторін гинули сотні священиків. Найбільшого розголосу набуло вбивство у 1623 р. греко-католицького архієпископа Йосафата Кунцевича натовпом православних віруючих, розлючених його спробами конфліктувати дві православні церкви. Занепокоєні братовбивчою боротьбою, кілька православних священиків, зокрема архієпископ полоцький Мелетій Смотрицький та ректор Київської братської школи Касіян Сакович, намагалися досягти компромісу, "що об'єднав би обидві Русі". Але хоч у Києві та Львові кілька разів скликалися собори, спроби примирення не мали успіху.
Розчаровані войовничою непримиренністю своїх православних співвітчизників, Смотрицький із Саковичем урешті-решт стали на бік греко-католиків. Тим часом інші представники православного духовенства звернулися за підтримкою до московського царя. Це не був безпрецедентний крок. Ще в 1570-х роках Львівське братство контактувало з православною Московії, а на початку XVII ст. багато українських православних ченців утікали до Московії від переслідувань католиків. У 1625 р., переконаний в тому, що православ'я від владою Польці не має майбутнього, митрополит Борецький звернувся до царя з проханням прийняти Україну під своє покровительство. Проте Москва реагувала з обмеженістю. Побоюючись викликати роздратування Польщі, вона надала українцям підтримку заохочуючим словом і грішми, не беручи зобов'язань стати на захист їхніх прав.
Боротьба між православними та греко-католиками спричинялася до такого хаосу, що врешті-решт у 1632 р. в неї втрутився польський уряд, нав'язавши компроміс. Православна ієрархія отримала офіційне визнання, що викликала суперечки, ділилася між двома церквам. Одним із головних "архітекторів" цього компромісу став митрополит Петро Могила - провідний український релігійний діяч XVII ст. Нащадок знатного молдавського роду, Могила, як і багато його співвітчизників, дістав початкову освіту у Львівській братській школі. Закінчивши навчання в Парижі, він повернувся на Україну, щоб зробити кар'єру священика. В 1627 р., у 31-річному віці, він стає архімандритом Києво-Печерської лаври, а через п'ять років - митрополитом київським.
Скориставшись із відносного спокою, що настав після 1632 р., Могила проводить конче необхідні реформи у православній церкві, її культурних та учбових закладах. Разом із групою освічених богословів і письменників, яку часом назвали Могилянським Атенеумом, він систематизував православні догми та обряди й підготував до друку перший православний Катехізис. Об'єднавши засновану ним у Києво-Печерській лаврі школу із школою Київського братства, Могила заклав підвалини так званої Могилянської колегії, яка згодом стала одним із найважливіших учбових закладів слов'янського світу. Взявши за взірець єзуїтські школи, особливу увагу в колегії звертали на вивчення класичних дисциплін, особливо латини та польської мови. Грецькій мові, такій популярній колись у братських школах, вже не вдавалося великого значення. Програма школи, заснованої Петром Могилою, свідчила про його прагнення поєднати традиції слов'янського православ'я з латинськими традиціями католицького Заходу. Але, захоплений культурою Заходу, митрополит Могила та коло його послідовників не розуміли, що латинські філософські трактати, історичні й поетичні твори приваблювали тільки невелику купку вчених-схоластів, а в українському суспільстві в цілому вони не знаходили широкого розуміння. Відтак між елітарними київськими схоластами та рештою українського суспільства поступово намітився культурний розрив.
У культурі українських верхів, тобто невеликої освіченої еліти, й далі панували релігійні теми. У більшості книжок, зокрема таких, як "Палінодія" Захарії Копистянського, "Зерцало богословія" Кирила Ставровецького, робилися способи продемонструвати істинність православ'я, довести, що воно - єдиний шлях до людського спасіння. Навіть у "бестселерах" того часу, призначених для масового вжитку, порушувалися теми житія святих чи давався каталог чудес, що відбувалися в Києво-Печерській лаврі. У переважній своїй більшості ці книги писалися складною для розуміння церковнослов'янською мовою, котра все ще використовувалася на Україні як літературна. Проте чим далі серед письменників поширювалася й "проста" мова. Так, Памва Беринда протягом 30 років складав свій "Лексикон", в якому подав до церковнослов'янських слів їхні українські відповідники. Новим фактом літературного життя того періоду стала зростаюча популярність поезії й особливо панегіриків. До найкращих зразків цього жанру належать "Вірші" Касіяна Саковича, написані на смерть Сагайдачного, та вірші, присвячені Петру Могилі. П'єси, що складалися й ставилися по школах, також були популярними й часто містили елементи народної творчості. В міру того як братські школи та Могилянська колегія випускали нові сотні студентів, а друкарні - нові книги, грамотність набувала на Україні дедалі відчутнішого поширення.
Якщо релігійне суперництво та західні зв'язки стимулювали культурний розвиток київської еліти, то в культурі народних мас і надалі знаходили відбиття землеробський стиль життя та умови пограниччя. Так, темами народних пісень, а багато з них мали давнє походження, були взаємини людини з природою, праця на землі, особисті стосунки між людьми. В них оспівувалися такі чесноти, як працьовитість, правдивість, висміювалися негідні вчинки. Найяскравішим виразом творчого духу народу в XVI - XVII ст. були думи. Їх співали мандрівні кобзарі в дні ярмарків чи релігійних свят, у козацьких таборах, на сільських майданах. В основному ці великі за розміром віршовані оповіді торкалися двох проблем, болючих для українського суспільства пограниччя: боротьба з турками й татарами та опір утискам шляхти.