Одри Хепбёрн начала актёрскую карьеру, снявшись в учебном фильме «Голландский в семи уроках». Далее были роли в музыкальном театре в таких постановках, как «Высокие ботинки на пуговицах», «Пикантный соус». Первый художественный фильм, в котором она приняла участие, был «One Wild Oat», где Одри сыграла девушку-регистратора в гостинице. Роль не принесла Одри особой известности, но зато позволила завязать полезные знакомства в мире кино, и была отмечена критикой, как многообещающая актриса. Далее последовали эпизодические роли в картинах «Рассказы молодых жён», «Смех в раю», «Банда с Лавендр Хилл», «Дитя Монте-Карло».
Впервые большая роль Одри в кино досталась в 1951 г. в картине «The Secret People», в которой ей отлично удалось изобразить артистку балета, ведь Одри в детстве провела несколько лет в балетной студии и благодаря этому заслужила одобрение критиков. Правда, некоторые считали её очень высокой для профессиональной танцовщицы, так как она часто оказывалась ростом выше многих танцоров мужчин.
Когда Одри Хепбёрн снималась в фильме «Дитя Монте-Карло», её утвердили на главную роль Бродвейской постановки «Жижи». Премьера спектакля была представлена 24 ноября 1951 г. Говорят, что автор постановки Сидони Колетт, увидев Хепбёрн, сказала « Вот наша Жижи!». За эту роль Одри поощрили Theatre World Award. Ещё полгода пьеса шла с большим успехом в Нью-Йорке.
Затем Одри пригласили в Голливуд на главную роль в голливудский фильм «Римские каникулы». Её партнером по сценическим съёмкам стал актёр Грегори Пек. В 1953 году Одри была признана лучшей исполнительницей женской роли в этом фильме. Грегори Пек оставался ей другом в течение всей жизни.
За «Римскими каникулами» следует фильм «Сабрина», где снимался актёр Уильям Холден. У Одри с ним завязался роман, и она собиралась за него выйти замуж. Когда Холден сказал ей, что сделал вазэктомию, она прервала с ним отношения.
В 1954 году Одри опять вернулась в театр, где сыграла русалку в пьесе «Ундина». Партнёр Одри по сцене Мел Феррер в том же году стал её мужем, и вскоре у них родился сын Шон. Русалка в «Ундине» была признана лучшей женской ролью 1954 года, за неё Одри была награждена премией «Тони».
Эта премия, последовавшая вслед за «Оскаром», повысила её репутацию как театральной актрисы, так и актрисы кино. К середине 50-х годов Хепбёрн становится законодательницей моды. Её особенный образ и неповторимый шарм привлекали толпы поклонников. После премьеры фильма «Сабрина» появилось понятие «Сабрина-декольте» из-за особого выреза на платье.
Став одной из популярных актрис, Одри снималась со многими ведущими актёрами, это Фред Астер в картине «Забавная мордашка», Морис Шевалье и Гарри Купер в фильме«Любовь после полудня», Джордж Пеппард в «Завтраке у Тиффани», Кэри Грант в нашумевшем хите «Шарада», Рекс Харрисон, Питер О’Тул в комедии «Как украсть миллион», Шон Коннери в «Робин и Мэриан». Большинство партнёров по фильмам становились её друзьями по жизни. Рекс Харрисон говорил, что Одри его самая любимая партнёрша.
Холли Гоулайтли, которую Хепбёрн сыграла в картине «Завтрак у Тиффани» в 1961 году, превратилась в культовый образ американского кино прошлого века. Эту роль Одри называла самой джазовой в своём творчестве. Когда её спросили, сложно ли было играть эту роль, Хепбёрн ответила, что она интроверт, поэтому ей было очень трудно изображать девушку-экстраверта.
На съёмках Одри часто одевала знаменитое «маленькое чёрное платье», которое стало хитом после появления фильма на экране. Кроме того, она высветлила некоторые пряди в своих каштановых волосах, создав тем самым свой неповторимый стиль, который сохраняла и после съёмок. Кстати, этот образ был придуман ею в соавторстве с Живанши, дружбу с которым Одри сохранила на всю жизнь и была его постоянной клиенткой.
В 1964 году выходит в свет мюзикл «Моя прекрасная леди» с её участием, который все ждали с нетерпением. Хепбёрн записала несколько вокальных партий для своей роли, но потом певица Марни Никсон все её песни перепела. Записи некоторых песен, которые Хепбёрн исполняла сама, существуют и они были включены в некоторые документальные фильмы. Отдельные вокальные номера Одри всё же оставили в фильме.
С 1967 года Хепбёрн снималась в кино только изредка. После развода с первым мужем она снова вышла замуж за Андреа Дотти, итальянского психиатра, и родила ещё одного сына Люка, затем переехала в Италию. В 70-е годы в Италии активизировалась террористическая деятельность, и Одри решила расстаться с Дотти и попытаться вернуться в кино. В 1976 году она снялась в картине «Робин и Мэриан» с Шоном Коннери. Фильм не получил такого же признания, каким отличались многие предыдущие фильмы с участием Одри.
В 1979 году Одри Хепбёрн попыталась ещё раз вернуться в кино, снявшись в картине «Кровные узы», К сожалению, фильм не получил должного успеха. Критики, даже из числа поклонников Одри, не рекомендовали фильм из-за его банальности. В 1980 году Хепбёрн стала встречаться с Робертом Уолдерсом, тоже актёром, их связь продолжалась до самой её смерти.
Одной из последних ролей Одри была роль в комедии «Они все смеялись» с партнёром Беном Газзаром. Фильм был небольшой и очень светлый — хороший номер под занавес для Одри Хепбёрн, Фильм был положительно оценен критиками.
В 1987 году Одри снялась в ироническом детективе «Любовь среди воров», он вобрал в себя некоторые элементы из её знаменитых фильмов, таких, как «Шарада» и «Как украсть миллион». Фильм имел умеренный успех, и Хепбёрн говорила, что принимала в нём участие от скуки.
В 1989 году Хепбёрн сыграла самую последнюю роль в кино — роль ангела в фильме «Всегда» Стивена Спилберга.